Yapı, Trabzon İmparatorluğu'nu kuran Komnenos ailesinden Kral I. Manuel tarafından 1250-1260 yılları arasında yaptırıldı. Bir manastır kilisesi olan ve 'Kutsal Bilgelik' anlamına gelen Ayasofya, Fatih Sultan Mehmet Han'ın 1461 yılında Trabzon'u fethinden sonra bir minber ve müezzin mahfili eklenerek camiye dönüştürüldü. I. Dünya Savaşı sırasında Trabzon'u işgal eden Rus ordusu tarafından depo ve askeri hastane olarak kullanılan yapı, savaş sonrasından 1959 yılına dek cami olarak kullanıldı. 1959-1964 yılları arasında Vakıflar Genel Müdürlüğü ve Edinburgh Üniversitesinin ortak çalışmalarıyla restore edilen tarihi yapının freskleri ortaya çıkartıldı. 1964 yılında müze haline getirilen Ayasofya, 3 Haziran 2013 tarihinde Kültür Bakanlığı tarafından Vakıflar Genel Müdürlüğüne teslim edildi. Ardından mahkeme kararları ve vakıf kaydı dolayısıyla Ayasofya, 28 Haziran 2013 Cuma günü 49 yıl sonra yeniden müslümanların ibadetine açılmıştı.